먹다. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
최근 ascomycete fungus Ilyonectria crassa가 감자 괴경을 감염시킬 수 있다는 것이 밝혀졌습니다. 이 연구는 감자에서 분리 된 I. crassa 균주의 일부 살균제에 대한 생물학적 특성과 내성을 분석 한 최초의 연구입니다. "감자"균주의 종 특이 적 영역의 순서는 수선화, 인삼, 아스펜 및 너도밤 나무, 백합 구근 및 튤립 잎의 뿌리에서 분리 된 곰팡이에 대해 이전에 얻은 것과 일치했습니다. 분명히 많은 야생 및 정원 식물은 I. crassa의 보호 구역 일 수 있습니다. 조사 된 균주는 토마토와 감자 슬라이스를 감염 시켰지만 전체 토마토 열매와 온전한 감자 괴경은 감염시키지 않았습니다. 이것은 I. crassa가 상처 기생충이라는 것을 보여줍니다. 플 루디 옥소 닐, 디페 노코나 졸 및 아족 시스트 로빈에 대한 내성을 영양 배지에서 평가 한 결과 이러한 약물의 높은 효능이 나타났습니다.
EC50 지수 (살균제 농도, 살 진균 대조군에 비해 콜로니의 방사상 성장 속도가 2 배 느려짐)는 0.4와 같았습니다. 각각 7.4 및 4mg / l. I. crassa로 인한 질병 발병 가능성은 감자 괴경의 식물 병리학 적 평가 및 식물 보호 조치 개발시 고려되어야합니다.
식물 병원성 미생물의 발달은 감자 재배 및 저장의 모든 단계에서 높은 손실을 초래합니다. 보호 조치를 계획 할 때 일반적으로 Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora 등의 종과 같은 잘 알려진 병원체가 고려됩니다. 그러나 최근 몇 년 동안 감자에 새로운 식물 병원성 미생물의 출현에 대한보고가 점점 더 많이 나타났습니다. 그들의 생물학은 제대로 연구되지 않았으며 감자와 관련하여 감자에 사용되는 살균제의 효과는 알려지지 않았으며 진단 방법은 개발되지 않았습니다. 대규모 개발로 감자 작물에 심각한 피해를 줄 수 있습니다. 이러한 미생물 중 하나는 자낭 균 균 Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous로, 감자 괴경에 대한 저자가 처음 발견했습니다 (Chudinova et al., 2019).
이 연구는 감자 괴경에서 분리 된 I. crassa 균주의 분석 결과를 제시합니다. I. crassa의 콜로니와 균사 구조의 형태, 종 특이 적 DNA 영역의 염기 서열, 감자와 토마토에 대한 독성, 일부 인기있는 살균제에 대한 내성이 연구되었습니다.
재료 및 방법
우리는 18 년 코스트 로마 지역에서 자란 감염된 감자 괴경에서 분리 한 I. crassa 2KSuPT2018 균주를 사용했습니다. 결절은 밝은 갈색 균사체로 덮인 구멍이있는 건조한 부패 유형의 영향을 받았습니다. 멸균 해부 바늘을 사용하여 진균 균사체를 한천 배지 (맥주 맥아 즙 10 %, 한천 1.5 %, 페니실린 1000 U / ml)가있는 페트리 접시에 옮겼습니다. 플레이트는 24 ° C의 어둠 속에서 배양되었다.
ICC2500 HD 디지털 카메라가 장착 된 Leica DM50 광학 현미경과 IC80HD 디지털 카메라가 장착 된 Leica M80 쌍안 현미경 (독일 Leica Microsystems)을 사용하여 포자와 포자 기관의 크기 및 형태를 촬영하고 평가했습니다.
DNA를 분리하기 위해 진균 균사체를 액체 완두콩 배지에서 성장시킨 다음 액체 질소에서 냉동시키고 균질화하고 CTAB 완충액에서 배양하고 클로로포름으로 정제하고 2 % 알코올로 두 번 세척했습니다.
DNA 추출 방법은 Kutuzova 등의 기사에 자세히 설명되어 있습니다. (2017).
분자 적 방법으로 종을 결정하고 다른 알려진 I. crassa 균주와 비교하기 위해 종 특이 적 DNA 영역을 증폭 할 수있는 프라이머로 PCR을 수행했습니다 : ITS1-5,8S-ITS2 (프라이머 ITS5 / ITS4, White et al., 1990), 유전자 영역 b -tubulin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) 및 번역 신장 계수 1α (tef1α) (프라이머 EF1-728F / EF1-986R, Carbone and Kohn, 1999). Evrogen CleanUp 키트를 사용하여 겔에서 원하는 길이의 앰플 리콘을 추출했습니다. 증폭 된 영역은 Applied Biosystems 3.1xl 자동화 된 시퀀서 (Applied Biosystems, CA, USA)에서 BigDye® Terminator v3730 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA)를 사용하여 시퀀싱되었습니다. 획득 한 뉴클레오티드 서열은 미국 국립 생명 공학 정보 센터 (NCBI)의 GenBank 데이터베이스에서 일치 항목을 검색하는 데 사용되었습니다. MEGA 6 프로그램을 사용하여 계통 발생 분석을 수행했습니다 (Tamura et al., 2013).
큰 열매를 맺은 토마토 (다양한 Dubrava)와 감자 괴경 (다양한 갈라)의 전체 녹색 과일에 대해 독성의 결정이 수행되었습니다. 또한 손상된 과일과 괴경의 손상을 시뮬레이션하기 위해 동일한 과일과 괴경의 조각을 사용했습니다. 덩이 줄기 조각을 습한 챔버에 넣었는데, 바닥에 젖은 여과지가있는 페트리 접시였습니다. 종이 위에 슬라이드를 놓고 그 위에 괴경이나 과일 조각을 놓았습니다. 전체 괴경과 과일도 바닥에 젖은 여과지가있는 용기에 담았습니다. 슬라이스의 중앙 (또는 결절이나 과일의 손상되지 않은 표면)에, 5 일 동안 맥아 즙 한천에서 성장한 후 곰팡이 균사가있는 한천 조각 (5 x 5 mm)을 놓았습니다.
살균제에 대한 곰팡이 균주의 내성 평가는 한천 영양 배지의 실험실 조건에서 수행되었습니다. 우리는 살균제 Maxim, KS (활성 성분 fludioxonil, 25g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250g / l), Scor, EC (difenoconazole 250g / l)에 대한 감수성을 연구했습니다 (주 카탈로그 ..., 2020). 평가는 0.1의 활성 물질 농도에서 연구 된 약물을 첨가하여 맥아 즙-한천 배지상의 페트리 접시에서 수행되었다; 하나; 1 ppm (mg / L) (플 루디 옥소 닐 및 디페 노코나 졸의 경우), 10; 십; 1 ppm (아족 시스트 로빈의 경우) 및 살균제 미포함 배지 (대조군). 살 진균제를 용융 된 배지에 첨가하고 10 ° C 배지로 냉각 한 후 배지를 페트리 접시에 부었다. 곰팡이 균사체가있는 한천 블록을 페트리 접시 중앙에 놓고 어둠 속에서 100 ° C의 온도에서 배양했습니다. 60 일의 배양 후, 콜로니의 직경은 서로 수직 인 두 방향으로 측정되었습니다. 각 콜로니에 대한 측정 결과는 평균화되었습니다. 실험은 세 번 수행되었습니다. 분석 결과를 바탕으로, 살 진균제 농도와 동일한 EC24을 계산하여 살 진균 대조군에 비해 콜로니의 방사형 성장 속도를 절반으로 줄였습니다.
결과 및 논의
맥아 즙 한천이 들어간 페트리 접시에서 곰팡이는 흰색 응집 균사체로 식민지를 형성했습니다. 균사체 아래의 배지는 적갈색으로 변했습니다. 배지가 마르면 곰팡이는 작은 포 자기의 단일 및 응집 된 분생 포자에 두 가지 유형의 포자를 형성했습니다. Macroconidia는 길쭉한 원통형이며 27.2 ~ 23.2 개의 격막, 평균 길이 32.2 µm, 값 범위는 4.9 ~ 1 µm, 너비-최대 14.3 µm입니다 (그림 10.3). 미세 분생 자의 평균 길이는 18.1 µm이고 값 범위는 4.0 ~ 2012 µm이고 너비는 최대 XNUMX µm입니다. 모든 거시적 및 미세 형태 학적 특성은 Ilyonectria crassa 종의 변형 범위에 적합합니다 (Cabral et al., XNUMX).
종 특이 적 DNA 영역 (ITS, b-tubulin, TEF 1α)의 서열은 이전에 연구 한 I. crassa 균주의 서열과 완전히 일치했습니다 (Chudinova et al., 2019, 표 1). 다른 지역에서 I. crassa의 유병률을 연구하고 영향을받은 배양 물의 스펙트럼을 분석하기 위해 GenBank 데이터베이스에서 유사한 DNA 서열을 분석했습니다 (표 1). 겹치는 부분은 86 ~ 100 %였습니다. “감자”I. crassa 균주의 1 개 DNA 영역의 서열은 네덜란드의 백합 구근과 수선화 뿌리 및 캐나다의 인삼 뿌리에서 분리 된 균주의 서열과 동일했습니다. 우리는 열린 데이터베이스에서 XNUMX 개의 분석 된 유사 서열을 가진 다른 I. crassa 균주를 찾을 수 없었습니다. 그러나 기탁 된 ITS 및 b- 튜 불린 서열의 분석은 영국의 튤립 잎에 I. crassa의 존재를 보여 주었다. 캐나다의 아스펜 뿌리와 이탈리아의 너도밤 나무 뿌리, 사우디 아라비아의 감자 괴경의 마이 코비 오타를 분석 할 때 유사한 ITS 서열을 가진 곰팡이가 확인되었습니다 (표 XNUMX). 이 연구의 결과는 I. crassa가 전 세계적으로 분포하고 있으며 다양한 식물 종을 감염시킬 수 있음을 보여줍니다.
5 일째 토마토와 감자 조각의 병원성을 확인했을 때 병변의 직경은 1.5cm에 이르렀고 조사 된 균주는 전체 토마토 열매와 온전한 감자 괴경을 감염시키지 않았다. 그러나 꽃받침은 토마토에 영향을 미쳤다. 감자 덩이 줄기 조각에서 발생하는 균사체의 오염 가능성을 배제하기 위해 곰팡이 분리 균을 순수한 배양 물로 분리했습니다. 부모의 균주와 완전히 동일했습니다. 분명히 I. crassa는 상처 기생충입니다.
곰팡이 제거제로 종자 괴경을 심기 전 처리하면 성장기 동안 식물의 질병 발병을 줄일 수 있습니다. 효과적인 살균제를 선택하려면 I. сrassa에 대해 효과적인 살균제를 평가하는 것이 중요합니다. 이 연구는 fludioxonil, azoxystrobin, difenoconazole과 같은 살균제의 광범위한 활성 물질을 연구했습니다. Fludioxonil은 심기 전에 씨앗과 종자 괴경을 드레싱하는 데 사용되는 여러 혼합물로 제조됩니다. Fludioxonil (Maxim)은 또한 저장 전에 종자 괴경을 치료하는 데 사용됩니다. Difenoconazole과 azoxystrobin은 종자 재료를 처리하는 데 사용되는 여러 제제와 식물을 처리하는 데 사용되는 제제에도 포함됩니다 (State catalog ..., 2020).
I. crassa의 성장률은 플 루디 옥소 닐 (EC2 = 50ppm), 아족 시스트 로빈 (EC0.4 = 50ppm) 및 디페 노코나 졸 (EC4 = 50ppm)과 같은 다양한 농도의 활성 성분을 사용하여 배지에서 연구되었습니다 (그림 7.4). 이러한 제제는 I. crassa에 대해 매우 효과적인 것으로 간주 될 수 있습니다. 그 이유는 EC2이 괴경 치료에 사용되는 작동 유체에서 제제의 권장 농도보다 상당히 낮기 때문입니다. State Catalog ... (50)에 따르면 감자 괴경을 처리하기위한 액체의 플 루디 옥소 닐 농도는 2020 ~ 500ppm, azoxystrobin (고랑 바닥 처리 용 액체)-1000-3750ppm, 디페 노코나 졸 (식물성 식물 처리 용 액체)-9375– 187.5 ppm.
표 1. Genbank 데이터베이스에서 사용 가능한 균주 18KSuPT2 및 Ilyonectria crassa 균주의 종 특이 적 서열 서열의 유사성
변형 | 숙주 식물, 배설 부위 | GenBank에 기탁 된 시퀀스 번호, 유사성 비율 | 링크 | ||
그 | β- 튜 불린 | 테프 1α | |||
17KSPT1 및 18KSuPT2 | 감자 괴경, 코스트 로마 지역 | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019,이 작품 |
CBS 158/31 | 수선화 뿌리, 네덜란드 | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | 카브랄 외, 2012 |
CBS 139/30 | Lily bulb, 네덜란드 | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | 인삼 뿌리, 캐나다 | 애 넥스 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | 튤립 잎, 영국 | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | 덴턴, 덴턴, 2014 |
MT294410 | 아스펜 뿌리, 캐나다 | MT294410 100 | ND | ND | 램스필드 외, 2020 |
ER1937 | 너도밤 나무, 이탈리아 | KR019363 99.65 | ND | ND | 티 자니, 해기, 모타. 직접 제출 |
KAUF19 | 감자 괴경, 사우디 아라비아 | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 년 |
ND = 입금되지 않음
표 2. 살균제에 대한 Ilyonectria crassa의 내성
(활성 물질) | EC50, ppm | ||||
3 일 | 5 일 | 7 일 | |||
제어 | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (플 루디 옥소 닐) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (디페 노코나 졸) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
우리 연구에서 I. crassa 균주는 코스트 로마와 모스크바 (Chudinova et al., 2019) 지역의 감자 괴경에서 분리되었습니다. I. crassa와 동일한 ITS 서열을 가진 높은 비율의 곰팡이 균주는 사우디 아라비아에서 감자 괴경의 mycobiota를 분석 할 때 밝혀졌습니다 (Gashgari and Gherbawy, 2013). 분명히 I. crassa는 감자에서 보이는 것처럼 드물지 않습니다. 우리의 실험은 곰팡이가 손상된 토마토 과일을 감염시킬 수 있음을 보여주었습니다. I. crassa는 토양에서 부영 양적으로 발달 할 수있을뿐만 아니라 수선화, 백합, 인삼, 아스펜 및 너도밤 나무와 같은 분류 학적으로 멀리 떨어진 다양한 식물에도 영향을 미칠뿐만 아니라 (Moll et al., 2016)도 알려져 있습니다 (표 1). 하나). 분명히 많은 야생 및 정원 식물은 I. crassa의 보호 구역 일 수 있습니다. 위의 내용은 보호 조치를 개발할 때이 곰팡이로 감자 괴경에 영향을 미칠 가능성을 고려할 필요가 있음을 보여줍니다. fludioxonil, azoxystrobin 및 difenoconazole을 함유 한 감자 괴경의 치료를위한 광범위한 제제는 I. crassa에 대해 높은 살균 효능을 보여주었습니다.
이 연구는 러시아 기초 연구 재단 (Grant No. 20-016-00139)의 지원을 받았습니다.
이 기사는 저널 "식물 보호 게시판", 2020, 103 (3)에 게재되었습니다.