D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S.N. Elansky, P.N. Balabko, G.L. Belova, S.K. Zavriev
식물 병원성 진균 인 Colletotrichum coccodes는 탄저병과 괴경 검은 반점으로 알려진 감자와 토마토에 위험한 질병을 일으 킵니다. 형태 학적 특성으로 인해 다른 미생물에 의해 유발되는 질병과 구별하기 어려운 경우가 많습니다. 녹색 토마토 과일에서 질병은 무증상 일 수 있으며 잘 익은 붉은 과일에서만 나타납니다. 병원균의 빠르고 정확한 진단을 위해 실시간 PCR 검사 시스템을 제공합니다. 테스트 시스템을 개발하기 위해 러시아 여러 지역의 감자 괴경에서 분리 한 45 C. coccodes 균주의 글리세롤 트리 포스페이트 탈수소 효소 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정했습니다.
얻은 결과와 GenBank 데이터베이스에서 사용 가능한 다른 종의 유사한 서열 분석을 기반으로 C. coccodes에 대한 종 특이 적 프라이머 및 프로브가 설계되었습니다. 생성 된 테스트 시스템의 특이성을 확인하기 위해 토마토 및 감자 식물 (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes)과 관련된 15 종의 기생 및 부영 양성 진균의 순수 배양에서 분리 된 DNA로 PCR을 수행했습니다. Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Colletotrichum coccodes DNA의 존재는 20-27의 임계주기에서 결정된 반면 다른 종은 40주기 후에 탐지되거나 탐지되지 않았습니다. 테스트 시스템은 분석 된 PCR 혼합물에서 0.01 ng / mm3를 초과하는 C. coccodes DNA 농도를 안정적으로 검출 할 수있게합니다. 개발 된 테스트 시스템을 사용하여 곰팡이 질병의 증상이있는 토마토 잎과 질병의 외부 증상이없는 감자 괴경에서 C. coccodes의 존재를 조사했습니다. 곰팡이 감염 증상이있는 잎은 Krasnodar Territory의 두 가지 분야, 괴경-Kostroma, Moscow, Kaluga, Nizhny Novgorod 지역의 들판에서 수집되었습니다. C. coccodes DNA를 포함하는 토마토 잎 하나가 Krasnodar Territory에서 발견되었습니다. 이 병원체의 DNA의 상당한 존재는 Kaluga 지역의 Kostroma, Moscow, Moscow에서 자란 5 개의 괴경 샘플에서 검출되었습니다.
소개
Colletotrichum 속의 균류는 곡물, 야채, 허브, 다년생 과일 및 장과 식물에 영향을 미치는 위험한 식물 병원균입니다. 이 속의 유비쿼터스 종 중 하나 인 Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes는 탄저병과 감자와 토마토의 검은 반점의 원인이되며 Solanaceae 계통의 다른 여러 식물에 질병을 일으 킵니다. 잡초 (Dillard, 1992). C. coccodes는 식물의 모든 지하 부분, 줄기 기저부, 잎 및 과일에 영향을 미칩니다 (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). 감염된 감자 괴경의 껍질에서 뚜렷하게 뚜렷한 가장자리가있는 회색 반점이 관찰되며 포자 형성과 미세 공막의 검은 점이 명확하게 보입니다. 저장 중에 내용물이 연화 된 궤양이 괴경의 치수에 형성 될 수 있습니다. 이 질병은 탄저병 단계에 들어가지만 극히 드뭅니다.
동시에 탄저병 (작은 검은 점이있는 피부 궤양)의 증상은 토마토 과일에서 전형적입니다. 잎에서 C. coccodes의 증상은 일반적으로 노란색 조직으로 둘러싸인 짙은 갈색 반점으로 나타납니다 (Johnson, 1994).
괴경에 검은 반점이 생기면 외모가 손상되며 특히 씻은 붉은 껍질 감자를 판매 할 때 두드러집니다. 껍질 각질 제거는 과도한 증발과 저장 손실 증가로 이어집니다 (Hunger, McIntyre, 1979). 다른 식물 기관의 손상은 수확량 손실로 이어지며, 이는 개방형 및 폐쇄 형지면 모두에서 기록되었습니다 (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). C. coccodes로 인한 질병은 러시아를 포함한 전 세계 거의 모든 감자 생산 지역에서 흔합니다 (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). C. coccodes에 대한 기존 살균제의 효과가 불충분하고 내성 품종이 없기 때문에 이러한 질병의 통제가 어렵습니다 (Read, Hide, 1995).
C. coccodes 접종 물은 종자 괴경 (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), 토마토 종자 (Ben-Daniel et al., 2010)에서 식물 잔해에서 오랫동안 생존 할 수 있습니다 (Dillard, 1990). ; Dillard, Cobb, 1993) 및 잡초 (Raid, Pennypacker, 1987). 여러 저자의 연구 (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993)는 감자와 토마토에서 질병의 발병이 종자에있는 접종 물의 존재에 크게 의존한다는 것을 보여주었습니다. 흙. 따라서 질병으로 인한 손실을 최소화하려면 종자 재료, 토양, 종자 감자 괴경 및 저장을 위해 놓인 토마토 씨앗에서 곰팡이의 번식을 진단 (정량 포함)해야합니다. 토양 및 식물 물질의 형태 학적 진단은 미세 균류 증의 존재에 의해서만 수행 될 수 있지만 다른 유형의 곰팡이에서도 발견됩니다.
괴경의 증상은 Helminthosporium solani 곰팡이로 인한 은색 딱지와 매우 유사합니다. Colletotrichum coccodes와 Helminthosporium solani를 순수한 배양 물로 분리하는 것은 다소 어렵고 영양 배지에서의 느린 성장으로 인해 오랜 시간이 걸립니다. Colletotrichum coccodes를 신속하게 식별하려면 도구 진단 방법을 사용해야합니다. 가장 편리한 방법은 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)과 그 변형 인 실시간 PCR입니다. 현재 영국 연구자들 (Cullen et al., 2002)이 rDNA의 ITS1 영역에 대해 개발 한 테스트 시스템이 유럽과 미국에서 사용되고 있습니다. 그것의 사용은 러시아 분리주의 분석에서 좋은 결과를 보여 주었다 (Belov et al, 2018). 그러나 C. coccodes는 매우 가변적이며 하나의 DNA 서열에서 검출되면 위음성 결과를 초래할 수 있습니다. 보다 신뢰할 수있는 진단을 위해서는 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 유전자의 염기 서열로 C. coccodes를 식별 할 수있는 독창적 인 테스트 시스템을 개발하여 여러 종 특정 DNA 염기 서열을 분석하는 것이 필요합니다.
재료 및 방법
생성 된 테스트 시스템의 효과와 특이성을 평가하기 위해 저자가 영향을받은 토마토, 감자 괴경의 잎과 과일 샘플에서 분리 한 15 종의 진균의 순수 배양 물을 사용했습니다 (표 1). 격리를 위해 곰팡이 감염 증상이있는 식물의 장기를 채취했으며 부시 당 하나 이상의 장기를 사용하지 않았습니다.
껍질이있는 괴경 한 조각, 토마토 열매 한 조각, 영향을받은 잎을 쌍안 현미경 아래에 놓고, 그 후 균사체, 포자 또는 조직 조각을 날카롭게 해부 바늘로 페트리 접시에있는 한천 배지 (워트 한천)로 옮겼습니다. 분리 물은 4 ° C에서 시험관의 한천 경사에 보관되었습니다.
수확 직후 (현장에서) 곰팡이 질병의 증상을 분석하기위한 토마토 잎 샘플을 70 % 에틸 알코올에 넣고 DNA 분리까지 보관했습니다. 감자 괴경을 실험실로 배달하고 껍질을 벗기고 (2 × 1cm 조각) –20 ° C에서 냉동했습니다. DNA 분리까지 냉동 보관.
DNA 분리를위한 진균의 순수한 배양액을 액체 완두콩 배지에서 성장시켰다. 진균의 균사체를 액체 배지에서 제거하고, 여과지에서 건조하고, 액체 질소에서 동결시키고, 균질화하고, CTAB 완충액에서 배양하고, 클로로포름으로 정제하고, 이소프로판올과 0.5M 칼륨 아세테이트의 혼합물로 침전시키고, 2 % 알코올로 70 회 세척 하였다. 생성 된 DNA는 탈 이온수에 용해되어 –20 ° C에 보관되었습니다 (Kutuzova et al., 2017). DNA 농도는 Qubit 3.0 (Qiagen, Germany)에서 이중 가닥 DNA에 대한 HS DNA 정량 키트를 사용하여 측정되었습니다. 알코올 화 및 냉동 샘플을 액체 질소에서 분쇄 한 다음, 위에서 설명한대로 DNA 추출을 수행했습니다 (순수 진균 배양의 균사체에 대해).
표 1. 사용 된 곰팡이 균주의 기원
버섯 이름 | 식물, 장기 | 선택 장소 |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | 감자 괴경 | 코스트 로마 지역, 1 세대 감자 괴경, 품종 Red Scarlett |
Colletotrichum coccodes 4 | 감자 잎 | 대표. 마리 엘, 요시 카르 올라 |
헬 민토 스포 리움 솔라 니 | 감자 괴경 | 마가 단 지역, pos. 텐트, 감자 괴경 |
클라도스포리움 풀붐 | 토마토 잎 | 모스크바 지역, 큰 과일 토마토 |
알터 나 리아 토마토 필라 | 토마토 과일 | 전 러시아 식물 보호 연구소의 균학 및 식물 병리학 실험실 직원이 제출했습니다. |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | 토마토 과일 | Krasnodar Territory, Krymsky 지구, 등급 Cream |
푸사 리움의 oxysporum | 밀 뿌리 | 모스크바 지역 |
PCR은 DTprime 증폭기 (DNA-Technology)에서 수행되었습니다. PCR의 경우 glycerol triphosphate dehydrogenase 유전자의 종 특이 적 영역에 대한 원래 프라이머와 프로브를 사용했습니다. 정방향 프라이머 Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, 역방향 프라이머 Coc280gdr-TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1, 프로브 프라이머는 213 bp 영역을 증폭합니다.
반응에는 총 DNA 50ng (잎과 괴경 분석시)과 10ng (순수 곰팡이 배양 DNA 분석시)가 필요했습니다. 반응 혼합물 (35μl)을 파라핀 층에 의해 두 부분으로 분리했습니다 : 아래쪽 하나 (20μl)에는 2μl의 10x 반응 완충액 (750mM Tris-HCl, pH 8.8; 200mM (NH4) 2SO4; 25mM MgCl2; 0.1 % Tween- 20) 0.5mM의 각 데 옥시 뉴클레오티드 트리 포스페이트, 7pmol의 각 프라이머 및 4pmol의 가수 분해 가능한 형광 프로브; 상단에는 1μl의 10x PCR 버퍼와 1U의 Taq 중합 효소가 포함되어 있습니다.
파라핀으로 혼합물을 분리하면 튜브를 5 ° C의 온도에서 장기간 보관할 수 있으며 10 ° C 이상의 온도에서 80 분 동안 가열 한 후 PCR을위한 hot start를 제공 할 수 있습니다. PCR은 다음 프로그램에 따라 수행되었습니다 : 94.0 ° C-90 초 (1주기); 94.0 ° C-30 초; 64.0 ° C-15 초 (5주기); 94.0 ° C-10 초; 64.0 ° C-15 초 (45 사이클); 10.0 ° C-보관.
결과 및 논의
글리세롤 트리 포스페이트 탈수소 효소 유전자의 서열은 러시아의 여러 지역에서 잎, 줄기, 감자 괴경 및 토마토 과일 (Kutuzova, 45)에서 분리 된 2018 개 균주에서 결정되었습니다. 모든 균주의 연구 된 서열은 2 개의 뉴클레오티드가 다른 496634 개의 그룹으로 나누어졌다. KY496635 및 KYXNUMX 번호로 두 그룹 대표의 뉴클레오티드 서열은 GenBank에 기탁됩니다.
기초로 설계된 프라이머 coc70gdf, coc280gdr 및 cocgdz 프로브는 BLAST 프로그램 (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) Colletotrichum 속 종의 글리세롤 트리 포스페이트 탈수소 효소 유전자의 모든 서열 및 GenBank 데이터베이스에서 이용 가능한 기타 유기체.
프라이머 및 프로브와 매우 유사한 다른 유기체의 DNA 영역은 발견되지 않았습니다.
테스트 시스템의 민감도는 C. coccodes DNA의 농도가 다른 샘플, 탄저병에 감염된 감자 잎의 DNA (Mari El, 품종 Red Scarlett에서 2017 년 수집), 검은 반점에 영향을받은 괴경 껍질 (코스트 로마 지역에서 수집, 다양한 Red Scarlett, 표 2). 괴경과 감자 잎에 DNA가 있는지 확인하기 위해 C. coccodes 균주를 순수한 배양 물로 분리했습니다.
테스트 시스템의 민감도 분석 결과는 PCR 혼합물의 총 함량이 0.05ng 이상인 경우 샘플에서 C. coccodes DNA의 존재를 성공적으로 진단하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다. 하나의 공막은 평균 0.131 ng를 포함하고 하나의 포자는 약 0.04 ng의 DNA를 포함하기 때문에 이것은 검출에 충분합니다 (Cullen et al., 2002). 영국 그룹 (Cullen et al., 2002)에 의해 개발 된 테스트 시스템은 유사한 민감도를 나타 냈습니다 (34 ng DNA에서 임계 값주기 0.05 및 37 ng에서 0.005).
모든 경우에 C. coccodes를 포함하는 천연 샘플을 분석하여 샘플에서 그 존재를 확실하게 드러 낼 수있었습니다 (표 2). 제안 된 DNA 분리 방법은 천연 식물 샘플 분석에도 적용 할 수 있습니다.
표 2. Real-Time PCR을위한 Colletotrichum coccodes의 식별을위한 제안 된 테스트 시스템의 민감도 결정
견본 | 샘플의 DNA 양 *, ng | 임계 값주기 | C. coccodes 탐지 |
---|---|---|---|
균사체 Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
괴경 껍질 1 | 50 | 32 | + |
괴경 껍질 2 | 50 | 30 | + |
괴경 껍질 3 | 50 | 31.5 | + |
감자 잎 | 50 | 29.5 | + |
노트. * PCR 제품의 혼합물에서.
테스트 시스템의 특이성은 15 종의 곰팡이에서 추출한 DNA 샘플에서 테스트되었습니다. 저자는 모든 종류의 곰팡이를 영향을받은 건강한 과일과 토마토 잎, 감자 괴경에서 분리했습니다. 밀 뿌리에서 한 균주를 분리했습니다 (표 1). 과일 표면에서 분리 된 것 중에는 토마토에 병원성이없는 종 (예 : Phellinus ferrugineovelutinus)이 있습니다.
연구에 따르면 C. coccodes DNA는 20 ~ 27의 임계주기에서 검출 된 반면, 다른 곰팡이 종은 검출되지 않았거나 40주기 이후 신호를 전달했는데, 이는 비특이적 소음 효과에 기인 할 수 있습니다 (표 3).
표 3. 다양한 버섯 유형에 대한 테스트 시스템 확인
버섯 이름 | 임계 값주기 |
콜레토트리쿰 cococodes 1 | 20.9 |
C. 코코 데스 2 | 22.6 |
C. 코코 데스 3 | 23 |
C. 코코 데스 4 | 22 |
푸사 리움의 oxysporum | > 40 |
F. 버티 실 리움 | > 40 |
리조토 니아 솔라 니 | > 40 |
포모프시스 파세올리 | > 40 |
알터 나 리아 알터 나타 | > 40 |
A. 토마토 필라 | > 40 |
헬 민토 스포 리움 솔라 니 | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
스템필리움 베시카리움 | > 40 |
일리오넥트리아 크라사 | > 40 |
클라도스포리움 클라도스포리오이데스 | > 40 |
C. 풀범 | > 40 |
아크로돈티움 루줄라에 | > 40 |
페니 실 리움 (Penicillium) 특검팀. | > 40 |
노트. * 모든 샘플의 DNA 양은 10ng입니다.
개발 된 테스트 시스템은 괴사 성 병원체의 증상이있는 토마토 잎 샘플에서 C. coccodes와 눈에 보이는 증상이없는 종자 감자 괴경을 확인하는 데 사용되었습니다. 연구를 위해 우리는 코스트 로마, 모스크바, 칼루가, 니즈니 노브 고로드 지역에서 자란 다양한 품종의 종자 괴경을 채취했습니다. C. coccodes DNA의 존재는 임계 값주기가 35를 초과하지 않는 분석에서 샘플에서 중요한 것으로 간주되었습니다.이 임계 값은 0.05ng의 C. coccodes DNA의 신뢰할 수있는 결정 (역치주기 33.5, 표 2) 및 다음 사실을 기반으로 선택되었습니다. 40 이상의 임계주기에서 다른 곰팡이 종의 비특이적 DNA가 진단되었습니다. 이 접근법을 통해 코스트 로마, 모스크바, 칼루가 지역에서 자란 5 개의 괴경 샘플과 크라 스노 다르 지역의 예이 스크 지역의 토마토 잎 한 개에서 C. coccodes DNA의 상당한 존재가 검출되었습니다 (표 4, 5).
표 4. 감자 괴경에서 Colletotrichum coccodes의 검출 *
샘플 번호 | 다양한 감자 | 성장의 장소 | C. coccodes 탐지 | 임계 값주기 |
---|---|---|---|---|
1 | 레드 스칼렛 | 코스트 로마 지역 | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | 산테 | 모스크바 지역 | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | 주 코브 스키 초기 | 모스크바 지역 | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | 몰리 | 칼루가 지역. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | 판타지 | 칼루가 지역. | - | |
15 | 갈라 | 니즈니 노브 고로드 지역. | - | |
16 | - |
노트. * 모든 샘플의 DNA 양은 50ng입니다.
표 5. 토마토 잎에서 Colletotrichum coccodes의 검출 *
샘플 번호 | 성장의 장소 | C. coccodes 탐지 | 임계 값주기 |
---|---|---|---|
1 | 크라 스노 다르 영토, 크림 지구 | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | 크라 스노 다르 영토, Yeisk 지구 | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* 모든 샘플의 DNA 양은 50ng입니다.
우리가 만든 테스트 시스템은 감도와 특이성면에서 영국 연구원 (Cullen et al., 2002)이 개발 한 시스템보다 열등하지 않으며 식물 샘플 분석에 적합합니다. 종자 괴경 분석에 적용함으로써 외부 손상 징후없이 괴경에서 C. coccodes DNA를 식별하고 잎의 감염을 성공적으로 분석 할 수있었습니다.
현재까지 러시아에서는 C. coccodes의 감염에 대한 감자 괴경에 대한 분석이 수행되지 않았습니다. 우리의 첫 번째 연구에 따르면 러시아 연방의 여러 지역에서 자란 16 개의 시험 된 종자 괴경 중 5 개에 C. coccodes가 포함되어 있습니다. 이것은 감자 괴경의 검은 반점이 러시아에서 흔한 감자 질병이며 감자 작물의 양과 품질을 줄이는 역할이 과소 평가되었음을 보여줍니다.
토마토 잎을 분석 한 결과 Krasnodar Territory의 Yeisk 지역에서 한 잎에 C. coccodes DNA가 유의하게 존재하는 것으로 나타났습니다. 이전에 영국 테스트 시스템 (Cullen et al., 2002)을 사용하여 러시아 남부의 토마토 밭을 조사했을 때 C. coccodes가 포함 된 잎이 발견되었으며 일부 밭에서는 C. coccodes에 감염된 잎이 많이 발견되었습니다 (Belov et al., 2018). 모스크바 지역의 Krasnodar와 Primorsky Territories에서 우리는 C. coccodes의 순수한 문화를 분리 할 수있는 토마토 과일을 발견했습니다. C. coccodes는 현재 믿어지고있는 것보다 러시아에서 토마토에 훨씬 더 널리 퍼져있을 가능성이 있으며 그 유해성도 과소 평가되고 있습니다.
따라서 현재까지 감자와 토마토에 대한 C. coccodes의 광범위한 분포에 대한 충분한 정보가 축적되었습니다.
감자와 토마토 질병의 발병에서이 곰팡이의 역할을 더 잘 이해하려면 러시아에서의 유병률을 모니터링하고 토양 및 종자 감염의 역할, 저장 중 손실에서 블랙 스팟의 역할을 연구해야합니다. PCR 진단을 사용하면이 작업을 상당히 용이하게 할 수 있으며 두 테스트 시스템을 동시에 사용하면 분석의 정확도가 크게 향상됩니다.
이 작업은 러시아 과학 재단 No. 18-76-00009의 보조금으로 지원되었습니다.
이 기사는 "Mycology and Phytopathology"저널 (54 권, No. 1, 2020)에 게재되었습니다.